Pancreatic and periampullary carcinoma. Proteomics and metabolite profiles

Abstract

Adenokarsinom med utgangspunkt i det periampullære området har fellesbetegnelsen periampullært karsinom og inkluderer pankreatisk duktalt adenokarsinom (PDAC), ampullært karsinom, duodenalt adenokarsinom og distalt kolangiokarsinom. Det kan være vanskelig å skille disse preoperativt fordi pasientene har sammenfallende symptomer og lignende radiologisk bilde. Grunnet uspesifikke symptomer blir disse kreftsykdommene som oftest oppdaget på et sent stadium og de fleste pasientene får derfor diagnosen når kreftsykdommen allerede har spredt seg. De fleste av disse pasientene (~85 %) er derfor ikke kandidater for potensielt kurativ operasjon. PDAC er den hyppigst forekommende (80 %) av de periampullære karsinomene og har den dårligste overlevelsen. Mens median overlevelsestid for alle pasienter med PDAC er 6-8 måneder. er median overlevelsestid omkring 22 måneder for de som gjennomgår kirurgi. Til tross for vellykket kirurgi får de fleste PDAC-pasienter tilbakefall innen to år. De norske retningslinjene for kjemoterapi i forkant av operasjon er forskjellige for de fire periampullære karsinomene. I tillegg har opptil 10 % av pasientene som blir operert for mistenkt kreft i dette området godartede sykdommer. Det er derfor viktig å forbedre den preoperative vurderingen av disse pasientene for å kunne skille malign og benign periampullær sykdom, skille de ulike periampullære karsinomene fra hverandre og kunne identifisere pasientene som vil ha nytte av kjemoterapi og operasjon.

I de tre artiklene inkludert i denne avhandlingen er det benyttet data fra kohorter med materiale fra opererte pasienter. Den ene kohorten består av pasienter med ondartet eller godartet sykdom i periampullærregionen. I den andre kohorten er det inkludert pasienter med kun PDAC eller godartet sykdom i pankreas. Blodprøvene og vevsprøvene som ble analysert var samlet inn henholdsvis før operasjon og fra operasjonspreparatet. Den kliniske informasjonen ble innhentet fra medisinsk journal retrospektivt. Den endelige diagnosen for samtlige pasienter i de to kohortene forelå etter patologisk vurdering av operasjonspreparatet.

Aminosyrer og derivater ble målt i plasma fra pasientene ved bruk av væskebasert kromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Vev fra PDAC, godartet pankreassykdom og PDXderiverte cellelinjer ble analysert med High-resolution Isoelectric Focusing (HiRIEF) LC-MS/MS for å få en total oversikt over proteomet. Overlappende deler av tidligere publiserte transkriptom- og mutasjonsdata ble inkludert i to av artiklene. Parametriske og ikkeparametriske tester for å undersøke sammenhenger og korreksjon for testing av multiple variabler ble gjennomført. Hovedkomponentanalyse (PCA) og hierarkisk klyngeanalyse ble utført for å identifisere undergrupper av pasienter i datamaterialet. Hovedutfall var total overlevelsestid (OS) etter operasjon. Kaplan-Meier estimator og Cox proporsjonal hasard regresjonsmodeller ble brukt til overlevelsesanalysene.

Over halvparten av aminosyrene og derivatene målt i plasma fra pasienter med ondartet sykdom hadde signifikant lavere nivåer enn plasma fra pasienter med godartet sykdom. Et unntak var glutaminsyre som hadde signifikant høyere nivåer i de maligne prøvene (FDR<0.05). Et PCA-plot fordelte pasientene i to grupper av hovedsakelig maligne eller benigne pasientprøver. En lignende fordeling ble vist med hierarkisk klyngeanalyse. Ved å undersøke sammenhenger mellom de kliniske og patologiske variablene og metabolittene, fant vi at høyt plasmanivå av aminosyren fenylalanin (HR=0.50, CI 0.30-0.83, P<0.01) og blodtype O sammenlignet med A (HR=2.14, CI 1.2-3.8, P<0.01) var assosiert med henholdsvis bedre og dårligere overlevelse. Hierarkisk klyngeanalyse basert på hele proteomet fordelte pasientene i fire klare grupper knyttet til celle- og vevssammensetning og diagnose. Ved å bruke Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) ble det identifisert fem proteinmoduler assosiert med spesifikke biologiske funksjoner. To av modulene besto av proteiner med betydelig høyere nivåer i tumorvev. Modulen som inneholdt proteiner knyttet til organisering av ekstracellulær matriks var også assosiert til kreftpasientenes overlevelse. Ved å sammenligne proteiner som hadde høyere nivåer i tumorvev med US Food and Drug Administration (FDA)-godkjente legemidler og mulige behandlingsmål ble det identifisert flere proteinkandidater. Disse kan vise seg å være angrepspunkter for behandling av PDAC.

Nivåene av både KRAS-protein og KRAS-mRNA var signifikant høyere i tumorvev fra PDAC sammenlignet med godartet pankreasvev (P<0.001). Nivåene av KRAS-protein var svakt korrelert med nivåene av KRAS-mRNA og KRAS-mutasjonstyper. Mutasjon i KRAS ble påvist i 87.8 % av tumorvev fra PDAC-pasienter. Hyppigst ble det påvist mutasjoner i KRAS p.G12D og p.G12V. Lavt nivå av KRAS protein (HR=4.62; 95 % CI 1.91-11.16; P<0.001) og mutasjonstype p.G12V (HR=2.26; 95 % CI 1.00-5.11; P<0.05) var begge assosiert med dårligere overlevelse. I denne avhandlingen har vi identifisert metabolitter og proteiner som kan skille mellom malign og benign periampullær sykdom, som er assosiert med prognose og som har potensiale som mulige angrepspunkter for medikamentell behandling av pasienter med PDAC. Vi har med dette økt datagrunnlaget og kunnskapen for videre forskning på PDAC og periampullære karsinomer.

Periampullary carcinomas originate in the periampullary region and include pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), ampullary carcinoma, duodenal carcinoma, and distal bile duct carcinoma. The four periampullary carcinomas are difficult to differentiate prior to surgery due to similar symptomatology and radiology imaging. The symptoms are often non-specific and lead to late detection. The majority of patients are diagnosed with locally advanced or metastasized disease and are not candidates for surgery with curative intent. PDAC is the most frequent (80 %) and has the poorest outcome of the periampullary carcinomas with a median overall survival of 6-8 months. The PDAC patients eligible for surgery with curative intent have a better, but still poor outcome with early relapse of the disease. The recommendations for neoadjuvant treatment differ for PDAC compared to the other entities. In addition, benign disease in the periampullary region can mimic carcinoma and up to 10 % of pancreatoduodenectomies are performed on patients with benign disease due to suspicion of malignancy. This emphasizes the importance of improving the preoperative work-up in order to distinguish between malignant and benign periampullary disease, differentiating the periampullary carcinomas, and identify the patients that will benefit from neoadjuvant treatment and surgery. In regard to the poor outcomes of the patients, the periampullary tumors’ molecular biology should be studied further to increase the knowledge and understanding of carcinogenesis and possible identification of new treatment targets.

Three papers based on two patient cohorts are the basis of this thesis. One cohort consists of patients with periampullary carcinoma and benign pancreatic disease. The other cohort included patients with PDAC and benign pancreatic disease. All patients underwent surgery for suspected malignancy in the periampullary region. Blood samples were collected preoperatively, tissue samples were from the surgical specimens, and the clinical information was gathered retrospectively. The pathology evaluation of the surgical specimen resulted in the definitive diagnosis.

Amino acids and derivatives were measured in plasma from patients with malignant and benign periampullary disease using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). High-resolution Isoelectric Focusing (HiRIEF) LC-MS/MS resulted in the total proteome of tissues from PDAC, benign pancreatic disease, and PDX-derived cell lines. Subsets of previously published transcriptomics and mutational data were included in the thesis. Statistical associations were evaluated using parametric and non-parametric tests with correction for multiple testing, as appropriate. Principal component analysis (PCA) and hierarchical clustering were performed to identify subgroups of patients. The main outcome was overall survival (OS). The survival analyses were performed using the Kaplan-Meier estimator and Cox proportional hazards regression models.

Significantly lower levels of approximately half of the 28 measured amino acids and derivatives were detected in plasma from patients with malignant compared to benign periampullary disease. Glutamic acid was one exception with significantly higher levels in the malignant samples (FDR<0.05). A PCA plot of the metabolite profiles separated the samples into two groups, mainly consisting of either malignant or benign patients. A similar distribution with two clusters were illustrated by a consensus clustered heatmap. When investigating the prognostic impact of clinicopathological variables and the metabolites, high plasma Phenylalanine (HR=0.50, CI 0.30-0.83, P<0.01) and blood type O versus A (HR=2.14, CI 1.2-3.8, P<0.01) were found to be associated with increased and poor overall survival, respectively.

Hierarchical clustering based on the total proteome divided the patients into four distinct clusters, consisting mainly of samples with tumor tissue, fibrosis, normal pancreatic tissue, and the PDX-derived cell lines, respectively. By using Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), five protein modules associated with specific biological functions, were identified. Two of the modules consisted of proteins that were particularly abundant in tumor tissue. The module associated with extracellular matrix organization, was also associated with prognosis of the PDAC patients. The proteins with higher levels in the tumor samples were cross-referenced with a list of FDA-approved drugs and potential targets, and several potential drug targets in PDAC were identified.

The KRAS protein levels and KRAS mRNA expression levels were significantly higher in tissues from PDACs compared to benign tissues (P<0.001). Poor correlations were observed, comparing the KRAS protein levels to KRAS mRNA expression levels and KRAS mutation types. A KRAS mutation was identified in 87.8 % of the PDAC tissues. Mutations in p.G12D and p.G12V were frequently detected. Low levels of KRAS protein (HR=4.62; 95 % CI 1.91-11.16; P<0.001) and mutation p.G12V (HR=2.26; 95 % CI 1.00-5.11; P<0.05) were both associated with poor OS.

In this thesis, we identified metabolites and proteins that have the potential to differentiate malignant from benign periampullary disease, are associated with prognosis, and may be potential drug targets for patients with PDAC. The -omics data contribute to the current knowledge of molecular biology of pancreatic and periampullary carcinoma.