Vis enkel innførsel

dc.contributor.authorLislevand, Jan Helge
dc.date.accessioned2009-12-01T10:04:00Z
dc.date.accessioned2017-04-19T13:13:45Z
dc.date.available2009-12-01T10:04:00Z
dc.date.available2017-04-19T13:13:45Z
dc.date.issued2009
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11250/2438921
dc.description.abstractNORSK: Mycoplasma genitalium er assosiert med infeksjoner i urogenitaltraktus hos kvinner og menn. Bakterien overføres ved seksuell kontakt og gir mange av de samme symptomene som Chlamydia trachomatis. De vanligste symptomene er utflod fra urinrørsåpningen og sviende smerter ved vannlating. Hos kvinner kan det dessuten være utflod fra skjeden som ved cervisitt. Mange av de M. genitalium infiserte vil imidlertid ikke ha symptomer, og er dermed asymptomatiske. M. genitalium er vanskelig å dyrke, og kryssreaksjoner med M. pneumoniae kompliserer serologiske metoder. I fravær av kommersielle molekylærgenetiske metoder er det i denne studien utviklet og etablert en Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) analyse som kan benyttes til rutinediagnostikk av M. genitalium innen medisinsk mikrobiologi. Analysen er optimalisert, verifisert og validert etter de kravene som er oppgitt i loven om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk (IVD direktivet), og er godkjent for prøvematerialene urin og endocervikalt sekret. Den egenutviklede analysen er kvalitativ og designet for påvisning av husholdningsgenet, glyceraldehyde-3-phosphate (gap), fra M. genitalium og en intern hemmerkontroll (MS2 DNA). Resultatene viste at Real-time PCR analysen har en deteksjonsgrense, LOD95 (Limit of Detection), på 35 bakteriegenom/PCR reaksjon for både biologisk og ikke biologisk materiale. Ingen krysshybridisering av mikrober, nært beslektet med M. genitalium eller tilhørende floraen i urogenitaltraktus, ble påvist med Real-time PCR analysen. Et BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) søk i GenBank viste eksakte treff av primerne og proben til kun sekvensene på gap genet til M. genitalium (aksesjonsnummer L43967). Amplifikasjonen viste en effektivitet på 107, 108 og 100 % for henholdsvis urin, cervikalt sekret og ikke biologisk materiale. Intra-assay variasjonen samlet, for alle materialene, varierte fra CV 0,5 % til CV 3,5 % ved høy konsentrasjon av templatet, og CV 0,4 % til CV 2,4 % ved lav konsentrasjon. Inter-assay variasjonen varierte fra CV 0,8 % til CV 3,7 % ved høy konsentrasjon, og CV 1,5 % til CV 2,4 % ved lav konsentrasjon. Undersøkelse av 50 positive og 50 negative pasientprøver viste at den egenutviklede analysen har en diagnostisk sensitivitet, spesifisitet, positiv og negativ prediktiv verdi på 100 %. Sammensetningen av PCR-miksen betraktes for å være egenprodusert og må dermed IVD godkjennes. Det er lite hensiktsmessig å påføre CE-merket på PCR-miksen, da den må lages like før bruk. CE-merket er påført en egenprodusert primermiksløsning som er en av ingrediensene i PCR-miksen. ENGLISH: Mycoplasma genitalium is associated with infections in urogenital tract. The bacterium is sexual transmitted, and causing many of the same symptoms as Chlamydia trachomatis. The most common symptoms are urethral secretions and burning pain at micturation. In women it can cause secretions from vagina. Many of the M. genitalium infected will have no symptoms, and these individuals can unknowingly spread the bacterium to others. M. genitalium is difficult to cultivate, and cross-reactions with M. pneumoniae complicating serological methods. In the absence of commercial molecular genetic methods, there is in this study developed and established a Real-time PCR (polymerase chain reaction) analysis that can be used for routine diagnosis of M. genitalium in medical microbiology laboratory. The analysis is optimized, verified and validated by the requirements specified in the law of medical equipment for in vitro diagnostics (IVD-Directive), and approved for urine samples and endocervical secretions. The self-developed analysis is qualitative and designed for the detection of the housekeeping gene, glyceraldehyde-3-phosphate (gap), from M. genitalium and an internal inhibition control (MS2 DNA). The results showed that the Real-time PCR assay has a detection limit, LOD95 (Limit of Detection), of 35 genome/PCR reaction for both biological and non biological materials. No cross-hybridization with microbes, closely related to M. genitalium or associated flora in urogenital tract, was discovered with the Real-time PCR analysis. A BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search in the GenBank showed exact match of primers and probe to the gap gene sequences of M. genitalium (accession number L43967). Amplification showed an efficiency of 107, 108 and 100 % for respectively urine, cervical secretions and non biological material. Intra-assay variation for all materials in total ranged from CV 0.5 % to CV 3.5 % at a high concentration of template, and CV 0.4 % to CV 2.4 % at low concentration. Inter-assay variation ranged from CV 0.8 % at CV 3.7 % at high concentration, and CV 1.5 % to CV 2.4 % at low concentration. Survey of 50 positive and 50 negative patient samples showed that the self-developed assay has a diagnostic sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of 100 %. The composition of PCR-mix is considered to be self-produced and must therefore be IVD approved. The PCR-mix is not suited for the CE-label while it must be prepared just before use. The CE-label is affixed to a self-produced primer mix-solution which is one of the ingredients in the PCR-mix.
dc.language.isonob
dc.publisherHøgskolen i Telemark
dc.subjectMycoplasma genitalium
dc.subjectUretritt
dc.subjectCervisitt
dc.subjectReal-time PCR
dc.subjectIVD-direktivet
dc.subjectCE-merking
dc.titleUtvikling og etablering av en kvalitativ Real-time PCR analyse for DNA-påvisning av Mycoplasma genitalium til diagnostisk bruk innen medisinsk mikrobiologi
dc.typeMaster thesis
dc.description.versionPublished version
dc.rights.holder© Copyright The Author. All rights reserved
dc.subject.nsi715


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel